アデノウイルスCas9発現ベクター

CRISPR/Cas9ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます（同様にZFNやTALENなどもよく利用されます）。

Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原生生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA（gRNA）と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。

CRISPRによる遺伝子ターゲティングには細胞内で標的配列特異的なgRNAとCas9が共発現している必要があります。Cas9とgRNAをひとつのベクター(all-in-oneベクター)から発現させるか、Cas9とgRNAをそれぞれ独立したベクターから発現させることによって共発現が可能になります。Cas9とgRNAの発現に独立したベクターを使うメリットは、実験目的に応じて様々なgRNAとCas9（野生株Cas9、ニッケース、不活性型Cas9など）を柔軟に組み合わせて使用できる点です。

アデノウイルスCas9発現ベクターはほとんどすべての哺乳類動物細胞にCas9を導入できます。ベクターDNAは宿主ゲノムへ挿入されずにエピソームDNAとして維持されるため、遺伝子治療やワクチン接種などのin vivoでの遺伝子導入に適しています。

アデノウイルスCas9発現ベクターはE.coliプラスミドとして作製され、パッケージング細胞に導入されるとITR(inverted terminal repeats)のあいだのCas9を含んだDNA領域がウイルスにパッケージングされます。ウイルスが標的細胞に感染するとウイルスゲノムはCas9と共に細胞核に入り、エピソームDNAとして維持されます。

アデノウイルスCas9発現ベクター上のアデノウイルス5型ゲノム（Ad5）はE1A、E1B、E3遺伝子を欠損しています（E1AとE1Bはウイルスの複製に必要）。その代わりにE1AとE1B遺伝子はパッケージング細胞に組み込まれています。そのため、当社のアデノウイルスCas9発現ベクターから作られるウイルスは複製不能（宿主細胞へ遺伝子の導入はできるが複製できない）であり、安全性が保障されています。

当社ではSpCas9（Streptococcus pyogenes由来のCas9）のバリアントを多数用意していますので、実験目的に適したCas9を選択できます。Cas9バリアントとして、１）ヒトコドン使用頻度に最適化され、効率的なDSB（double-strand breaks）生成が可能なhCas9、２）DNAの一本鎖切断（ニック）のみを生成するhCas9ニッケース変異体hCas9-D10A、３）D10AとH840A変異を持つ不活性型hCas9であるdCas9、４）オフターゲット活性を減少させ、特異性を高めたSpCas9-HF1とeSpCas9を用意しています。加えて、dCas9と転写活性化ドメインの融合タンパク質であるdCas9/VP64、dCas9/VPR（CRISPRa用途）や転写抑制ドメインの融合タンパク質dCas9/KRAB（CRISPRi用途）も利用できます。その他にも、遺伝子サイズの小さいCas9バリアントが必要ならばStaphylococcus aureus由来のSaCas9や、DSB後に突出末端を生成するAcidaminococcus 由来のAsCpf1が用意されています。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

当社のアデノウイルスCas9発現ベクターはアデノウイルス５型（Ad5）を基に開発されています。E.coliでの高コピー数複製、高タイターのウイルス作製、広範囲な細胞タイプへの高効率な導入および高レベルのCas9発現と標的配列特異的なgRNAによる高効率のCRISPRターゲッティングを可能にします。実験目的に応じて数々のCas9バリアントが用意されています。

柔軟性：Cas9発現ベクターは複数のgRNA発現ベクターと組み合わせて同時に複数のゲノムサイトを標的にできます。

宿主ゲノムの損傷リスクが低い：宿主細胞に感染したアデノウイルスベクターは細胞核内でエピソームDNAとして維持されます。ゲノムへの挿入が起こらないために、ゲノムの損傷よる癌化の可能性が低く、ヒト生体に使用する用途などに理想的です。

非常に高いウイルスタイター: アデノウイルスベクターをパッケージング細胞に導入してウイルスを作製した後に、パッケージング細胞に再感染させることでウイルスを増幅して非常に高いタイターを得られます。このような増幅はレンチウイルス、MMLVレトロウイルス、AAVなどではできません。当社のアデノウイルス作製サービスを利用していただければ、10¹¹ PFU/ml（plaque-forming unit per ml）以上のタイターを得ることができます。

幅広い親和性：ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類動物由来の細胞に遺伝子を導入できます。ただし、いくつかの細胞タイプへの遺伝子導入は困難であることが知られています。

In vitroとin vivoで有効：培養細胞と生体内の細胞に対しても使用できます。

安全性：当ベクターからはウイルス作製に必須の遺伝子が取り除かれているため（それらの遺伝子はパッケージング細胞のゲノムに組み込まれています）、当ベクターから作られるウイルスは複製不能であり安全です。

ベクターDNAがゲノムに挿入されない：アデノウイルスゲノムは宿主のゲノムに挿入されずにエピソームDNAとして維持されます。そのため、エピソームDNAは時間経過とともに失われます。

特定の細胞タイプへの遺伝子導入が困難：アデノウイルスベクターは非増殖細胞を含む数多くの細胞タイプへの遺伝子導入が可能ですが、特定の細胞タイプ（内皮細胞、平滑筋、気道上皮細胞、末梢血細胞、神経細胞、造血細胞など）に対する導入効率は低くなります。

強い免疫原性: アデノウイルスベクターから作成されたウイルスは動物生体内で免疫反応を引き起こすことがあるので、特定のin vivo用途には制限があります。

技術的な複雑さ：アデノウイルスベクターはパッケージング細胞によるウイルス作製とタイターの正確な計測などの操作が必要になります。従来のプラスミドを使った遺伝子導入と比べてこれらは高い技術の習熟が必要となり、時間もかかります。

PAMが必要：CRISPR/Cas9システムはgRNA認識配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。必要になるPAM配列は使用するCas9バリアントに依存します。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. 野生株の5' ITR と3' ITRは基本的に同じ配列を持つ。ウイルスゲノムの両端に逆向きに配置され、ウイルスゲノムの複製起点として機能する。

Ψ: アデノウイルスゲノムDNAのパッケージングシグナル。

Promoter: Cas9バリアントを発現するプロモーター。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

ORF: Cas9バリアントの遺伝子。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。

hPGK promoter: ヒトphosphoglycerate kinase 1 遺伝子プロモーター。下流のマーカー遺伝子を遍在的に発現する。

Marker:薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）、視覚化用遺伝子（EGFPなど）、デュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

TK pA: 単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのポリアデニレーションシグナル。マーカー遺伝子の転写を停止する。

ΔAd5: アデノウイルス5型（Ad5）ゲノム。E1A、E1B、E3領域が欠損している。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

pBR322 ori: pBR322複製起点。E.coliでプラスミドを中コピー数で維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

PacI: PacI制限酵素認識サイト（TTAATTAA）。2ヵ所のPacIサイトで切断することによってベクターを線状化し、ベクターバックボーンを取り除いて効率的なパッケージングを実現する。